多重免疫荧光（mIHC）解析三级淋巴结构（TLS）对抗肿瘤免疫的重要作用

三级淋巴结构（Tertiary lymphoid Structures, TLS）又名第三淋巴样器官或异位淋巴样结构，是非生理条件下非淋巴组织中后天产生的有组织的免疫细胞聚集体，一般出现于自身免疫性疾病、慢性感染、癌症所致的慢性炎症组织中。除少数特殊情况例外，若肿瘤中出现TLS，一般都意味着免疫治疗后的临床结果和预后情况更好。

B细胞和T细胞是形成TLS的主体部分。TLS的具体组成可能有所不同，但在T细胞亚群中，CD4+T滤泡辅助细胞（Tfh）通常是主要的细胞亚群，也存在CD8+T细胞、Th1、Treg细胞。除了B细胞和T细胞之外，在TLS内部还有其他细胞群体，比如DC（树突状细胞），包括间质来源的CD21+滤泡树状细胞（FDC），定位于T细胞区的CD83成熟DC(也有研究称为树突状细胞—溶酶体相关膜蛋白（DC-LAMP）)，以及滤泡中用于清除凋亡细胞的CD68巨噬细胞。此外，还含有大量基质细胞发挥类似SLO（次级淋巴）组织中滤泡网状细胞（FRC）的作用，可将TLS锚定在慢性炎症部位。最后，还有高内皮细胞微静脉（HEV）提供与 TLS 相关的特殊脉管系统，介导淋巴细胞的募集。

TLS的构成

文献介绍一

2020年1月15日，美国The University of Texas MD Anderson Cancer Center的Jennifer A. Wargo团队在Nature（IF:64.8）上发表了题为“B cells and tertiary lymphoid structures promote immunotherapy response”的研究论文。该研究利用多重免疫荧光技术联合多组学技术在转移性黑色素瘤和肾细胞癌患者（RCC）两个队列中发现B细胞和TLS在ICB（免疫检查点阻断）治疗中的积极作用。

该研究首先在先前一项ICB新辅助治疗黑色素瘤患者2期临床试验的基础上，进一步对该患者队列的肿瘤样本进行了RNA测序，结果发现响应ICB疗法的肿瘤（以下称为应答者）患者组织中，B 细胞相关基因（如 MZB1、JCHAIN 和 IGLL5）的表达显著上调，且能够影响B细胞功能的基因如FCRL5、IDO1、IFNG和BTLA也在应答者中显著富集。同样地，肾细胞癌队列中也发现B细胞相关基因显著富集在应答者中。

接下来，为深入了解应答者肿瘤组织中B细胞的表达分布以及它们和TLS之间的关系，研究人员对黑色素瘤患者的肿瘤样本进行了组织学评估。结果表明，应答者肿瘤组织中B细胞的标志物CD20和TLS的密度以及TLS与肿瘤面积的比率均高于无应答者，尤其是在早期治疗的样本中。进一步的结构分析表明，CD20 B 细胞定位于应答者肿瘤的 TLS 中，并与 CD4、CD8 和 FOXP3 T 细胞共定位，还显示与 CD21 滤泡树突状细胞和 MECA79 高内皮静脉共定位。在肾细胞癌队列中观察到类似的结果。

多重免疫荧光Panel组合：

随后，研究人员进行了几项深入分析，以了解浸润B细胞的表型和功能以及它是如何促进患者进对ICB的响应。结果发现，应答者中B细胞受体（BCR）重链和轻链的克隆数明显增加，BCR的多样性也明显增加。同时，RNA-seq和CyTOF(质谱细胞术)分析显示，应答者的浆细胞和记忆B细胞明显高于无应答者。这些结果表明了B细胞在抗肿瘤免疫中发挥积极作用。

总之，本篇文章通过多种手段分析了黑色素瘤和肾细胞癌患者组织中免疫细胞的组成，发现了TLS中的B细胞与肿瘤患者对ICB治疗的响应呈正相关。该研究对生物标志物和治疗靶点的开发具有重要意义，同时也为B细胞和TLS在ICB治疗反应中的作用提供了重要的见解。

文献介绍二

2021年8月12日，来自法国巴黎Unicancer的肿瘤内科医生Antoine Italiano在Nature Cancer上发表了题为“Mature tertiary lymphoid structures predict immune checkpoint inhibitor efficacy in solid tumors independently of PD-L1 expression”的文章，通过对接受抗 PD1/PD-L1 抗体治疗的三个独立癌症患者队列的大规模回顾性分析，发现成熟TLS的存在与几种肿瘤类型的生存率提高相关，而与PD-L1表达状态和CD8+ T细胞密度无关。该项研究为使用TLS作为生物标志物来选择更有可能从免疫检查点抑制剂中受益的患者铺平了道路。

首先由病理学家评估了328名接受抗PD-1或抗PD-L1单克隆抗体治疗的患者的肿瘤样本中TLS的状态，结果发现有105例患者的组织中存在TLS，其中多重免疫荧光结果显示有84例具有成熟的TLS（mTLS，定义为 TLS 结构中存在 CD23+ 滤泡树突状细胞）并表现出更好的临床预后。

多重免疫荧光Panel组合：

随后，在发现队列中进一步分析了PD-L1 表达评分、CD8+ T 细胞浸润、TLS 状态和患者预后之间的相关性。结果发现，无论PD-L1表达状态如何，成熟TLS阳性肿瘤患者预后均较好。

总而言之，在这项泛肿瘤研究中证明了TLS可作为评估患者对免疫治疗反应的预测因子，此外，成熟TLS的预测价值似乎不受特定肿瘤类型的驱动，在大多数肿瘤类型中能够观察到预后更好患者的比例增加。

文献介绍三

2021年7月1日，美国西北大学联合冷泉港实验室在npj Breast Cancer上发表了题为“Spatial distribution of B cells and lymphocyte clusters as a predictor of triple-negative breast cancer outcome”的文章，研究了 B 细胞和 T 细胞以及淋巴细胞簇（LC）在三阴性乳腺癌（TNBC）肿瘤中空间分布的临床相关性。

研究人员首先利用多重免疫荧光技术将36名原发性TNBC患者的肿瘤样本划分为了肿瘤区与间质区，然后评估了肿瘤区和间质区B细胞CD20的密度与临床结果的相关性，结果表明，基质中的B细胞在空间上更加分散，临床结果良好。

多重免疫荧光panel组合：

进一步，使用基于密度的聚类算法（DBSCAN）鉴定了成簇淋巴细胞（LC）与分离淋巴细胞在空间上的分布情况。LC由纯的T细胞或T细胞与B细胞混合组成，而TLS是淋巴细胞簇的子集。研究发现，各类型淋巴细胞簇在预后良好的患者中相比预后差的患者中数量更多。

总之，该研究通过分析TNBC样本中肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的空间分布，证明了预后良好的肿瘤中B细胞和淋LC在空间上更分散，数量也更多，进一步阐明了肿瘤内B细胞和LC空间分布的重要性。

虽然哪一类B细胞亚群以及TLSs通过何种机制促进了机体对ICB治疗的响应还有待研究，但以上三篇文章通过大量的队列研究和肿瘤微环境免疫细胞组分的分析，证实了肿瘤浸润B细胞和肿瘤中TLS与患者对ICB治疗的响应以及预后有较强的相关性，为肿瘤免疫治疗提供了新的策略和思考空间。

知微生物实验室在贲门癌组织中搭建了TLS的染色Panel，染色结果如下：

参考文献

Schumacher TN, Thommen DS. Tertiary lymphoid structures in cancer.Science.2022;375(6576):eabf9419.doi:10.1126/science.abf9419
Helmink BA, Reddy SM, Gao J, et al. B cells and tertiary lymphoid structures promote immunotherapy response. Nature. 2020;577(7791):549-555. doi:10.1038/s41586-019-1922-8
Vanhersecke, Lucile et al. “Mature tertiary lymphoid structures predict immune checkpoint inhibitor efficacy in solid tumors independently of PD-L1 expression.” Nature cancer vol. 2,8 (2021): 794-802. doi:10.1038/s43018-021-00232-6IF: 23.5 Q1
Wortman JC, He TF, Solomon S, et al. Spatial distribution of B cells and lymphocyte clusters as a predictor of triple-negative breast cancer outcome. NPJ Breast Cancer. 2021;7(1):84. Published 2021 Jul 1. doi:10.1038/s41523-021-00291-zIF: 5.9 Q1

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