Nat Rev Cancer | 多重蛋白质成像技术结合空间组学高粒度分析肿瘤

近年来，癌症生物学的组学研究已经从包含许多细胞类型和亚型的大块肿瘤组织分析，转向了对肿瘤细胞和肿瘤相关细胞的单细胞分析。尽管它们做出了许多重要贡献，但解离的单细胞分子分析技术无法获取关键的空间信息。在这里，作者回顾了多重、基于蛋白质的、单细胞分辨率成像方法的发展和最新技术，重点关注它们在空间肿瘤生物学中的应用。

总之，利用空间、单细胞分辨方法研究肿瘤微环境中的空间结构和信息交换，将有助于理解肿瘤的许多特征，以及揭示肿瘤中细胞间通信如何受到治疗的调节。

肿瘤可以被概念化为一个异质细胞类型的生态系统，它们动态地交换信息以相互影响。在本节中，作者讨论了多重成像处理的肿瘤特征，包括从单个细胞的表型到肿瘤微环境（TME）的大尺度特性（图1a），并概述了目前已经进行的分析类型。

要理解肿瘤生态系统，首先最重要的是识别存在的细胞表型。单细胞分辨率的多重成像技术非常符合要求，因为它可以区分数十个标记物（通常为10-50个），而不是标准荧光成像中的3或4个标记物。多重成像研究中的panel设计常用于识别肿瘤、免疫或基质区域内感兴趣的已知细胞亚型和状态。在对充分描述的临床队列进行研究时，通过多重蛋白质图像分析（如细胞表型、状态、相互作用或空间模式等），所量化的肿瘤微环境（TME）特征可以在统计上与人口特征（如性别或年龄）、临床特征（如肿瘤亚型、对治疗的反应或总生存率）相关联，或者可以在不同于任何定义的人口或临床特征的队列组之间进行比较。这些关联识别出分层或预后特征，有助于理解临床结果（图2）。

总之，肿瘤、免疫、基质或任何其他细胞表型都可以用于研究人类肿瘤中的细胞异质性以及特定表型可能与感兴趣的临床或分子特征相关联的方式。

2、肿瘤中细胞类型之间的相互作用

肿瘤中的细胞并不是孤立的实体，而是通过与周围细胞和基质的持续物理和化学接触来感知其环境。反过来，细胞将这些信息与其内部状态整合，并向其环境发送信号。检测这种相互作用并推断不同细胞表型之间的通信，以及将它们与肿瘤生物学的任何方面联系起来，是多重蛋白质成像的一个令人兴奋的方面。这样的分析可以推断分子途径，如在肿瘤内可能活跃的信号途径，帮助理解细胞的邻居如何影响其状态，并识别可能具有功能后果的肿瘤的微妙组织特征。

总的来说，通过以单细胞分辨率成像肿瘤中的许多细胞类型，可以确定哪些细胞类型更有可能彼此靠近，甚至是直接相邻，以及哪些细胞类型倾向于避开彼此，从而提供了对细胞相互之间的功能效应的洞察，并了解这如何与疾病的临床和生物学特征相关联的信息。

除了细胞间的相互作用外，肿瘤中还存在空间模式，这些模式对疾病的表现至关重要。这些结构包括从小型局部细胞或分子聚集到大型结构如血管或淋巴管等，它们可能影响细胞间的通信并且受到其影响。肿瘤的组织结构具有重要的预后特征，如肿瘤分级和组织学亚型。多重成像方法有助于分子级别地阐明肿瘤中的空间特征。

基于同时分析的细胞类型数量，多重肿瘤成像数据的空间分析方法可以被广泛分类（图3）。最简单的是确定单个细胞类型在整个肿瘤内或相对于某些空间标志物（例如肿瘤内血管或肿瘤-基质边界）的空间位置分布，这被称为一阶分析（图3a）。二阶分析（图3b）的目标是确定不同细胞类型之间在空间上的分布，或者相对于整体组织结构的位置。例如，在针对三阴性乳腺癌的研究中，Keren等人根据肿瘤细胞与免疫细胞相互作用和免疫细胞间相互作用的比率，将肿瘤分为冷区（免疫细胞较少）、隔离区（免疫细胞存在但与肿瘤在空间上分离）或混合区（免疫细胞存在且与肿瘤在空间上混合）三种类型，并表明隔离区的肿瘤预后比混合区的要好。

此外，高阶分析（Higher-order analyses）定义了更多细胞类型的局部富集模式（图3c-3e），例如，邻域（neighbourhood）、社区和环境（community and milieu）。在一项针对结直肠癌的CODEX研究中，Schürch等人定义了富集特定细胞类型的局部区域，他们称之为细胞邻域（图3c）。基于邻域内细胞类型的分数对细胞进行了聚类，得到了9个可以注释为T细胞富集、巨噬细胞富集、肿瘤组织或免疫浸润基质等的细胞邻域。分析也可以采取自上而下的策略，从组织学或经典荧光染色中识别的空间结构开始，然后使用多重成像来更详细地表征底层细胞和分子（图3f）。

4、队列设计以确定临床相关性

总之，多重成像方法展示了在人类肿瘤组织中识别信息丰富的分子、细胞、多细胞和空间特征的潜力。要将这些特征与临床数据关联起来，队列设计至关重要。确保临床数据尽可能完整和详细地注释，队列组间的平衡也很重要，特别是在涉及年龄、性别、遗传祖先和肿瘤亚型的组间比较时。此外，了解患者的治疗历史以及对数据解释至关重要。队列大小应该根据预期效应大小进行估计，但通常情况下这是未知的。对于特定的临床问题，尤其是涉及治疗反应的问题，来自对照临床试验的样本可能是最有成果的途径。

根据读数和探针的使用，单细胞分辨率的多重蛋白质成像或分析方法可以分为四类（图4），质谱法、荧光或染色成像、基于寡核苷酸的荧光成像或测序等，这些方法在处理组织自发荧光的水平、信号放大的可能性以及线性量化目标而不仅仅是给出二进制正或负信号的能力上有所不同，所有这些都会影响性能。

1、质谱读数

MIBI和IMC依靠质谱法来检测与抗体偶联的金属同位素，可同时染色多达40-50个标记物，并兼容RNA和DNA检测，并且由于它们是基于检测外源性添加的非生物金属同位素，因此避免了荧光和染色技术产生的背景信号。IMC已扩展到三维成像，可在单细胞水平对样本进行3D重建。它已经与基于循环杂交的金属标记寡核苷酸的交换反应（SABER）相结合，能够实现高达68倍的信号放大，使得难以用标准方法检测到的低丰度分子的成像成为可能。这两种方法均已商业化，IMC仪器仍在商业上可用。两者均适用于冷冻和FFPE组织样本，并且都已在几项临床队列研究中应用。关键挑战是这些方法的扫描速度相对较低，因此与免疫荧光或免疫组化（IHC）相比，它们通常用于较小区域的成像。

荧光成像方法大致可以分为两类：多光谱成像和迭代荧光成像。多光谱成像使用计算方法对重叠的荧光光谱进行拆分，已实现高达20个目标的成像，例如商业化的多光谱仪器，PhenoImager HT（以前称为Vectra Polaris）和Orion。迭代荧光成像可以实现40-50个目标的染色成像，其中每一轮染色和成像之后都跟随抗体去除或荧光素失活（图4b）。几种迭代荧光方法已经商业化。循环荧光方法可以方便地使用商业化的抗体，最近已开始应用于患者队列，但由于达到高多重度所需的时间较长，以及荧光信号的去除可能会改变或破坏抗原表位和组织结构，因此具有挑战性。

传统免疫组化技术是一种成熟的临床病理学技术，已被用于以迭代模式实现多重蛋白质成像（图4b）。每个抗体均通过基于辣根过氧化物酶（HRP）的色素沉积进行成像检测，然后用有机溶剂脱色。在单玻片上的多重免疫组织化学连续染色中，有效的染色和去染色需要阻断前一个抗原位点以克服不完全脱色。多重免疫组化已经应用于众多患者队列中。然而，与迭代荧光成像相比，这些方法更耗时，图像配准存在挑战。

4、基于寡核苷酸标记抗体的荧光或测序读数

通过顺序检测的多重成像也已经通过 CODEX 中的寡核苷酸标记抗体实现（图4c）。最初，CODEX采用引物延伸和化学还原去除荧光染料的方法进行荧光标记，然后升级为更快速的杂交和剥离互补的成像探针。该方法需要将抗体与DNA条形码结合，并验证结合的抗体。CODEX已由Akoya Biosciences商业化，并应用于患者队列中。由于CODEX缺乏放大作用，与二级抗体或HRP相反，它是每个成像探针包含单个荧光素，所以灵敏度可能是一个挑战。Immuno-SABER（具有SABER的免疫染色）的开发解决了这个问题，它可以将荧光信号放大至188倍，同时保持多重性。

多组学分析目前处于肿瘤生态系统原位研究的前沿，迄今为止，大多数研究都集中在将转录水平数据与蛋白水平数据合并（图5）。单细胞转录组原则上可以提供对肿瘤中细胞类型更全面和更细致的视角，因为它们测量的特征数千个，而不是多重蛋白成像访问的几十个特征。然而，在实践中，空间分辨率单细胞转录数据的相对稀疏意味着这一潜力尚未实现。

多组学数据可以通过实验（即通过同时检测两种或多种分子类）或通过数据整合来实现。例如，通过金属同位素标记探针检测RNA，实现了蛋白质和RNA的同步成像，这样RNA-IMC就可以用于检测同一样品上的蛋白质和mRNA（图5a）。

另一种同时进行蛋白质和转录物分析的方法是通过测序使两种分子都可检测到，采用不同的策略在空间映射测序结果。包括两种方法：确定性条形码在组织测序（DBiT-seq）和空间细胞转录组和表位的索引化测序（spatial-CITE-seq）（图5c）。这些方法允许在特定空间尺度下对蛋白质和转录物进行高分辨率的定位，例如在小鼠胚胎中的像素尺寸为10μm，以及在小鼠和人类组织中的像素尺寸为25μm。虽然这些方法已接近单个细胞的尺度，但仍然无法实现组织内真正的单细胞分辨率。因此，结合其他技术数据如单细胞RNA测序（scRNA-seq）、组织切片染色（H&E）或免疫荧光数据，可以帮助对单个细胞进行注释。

空间多组学（SM-Omics）方法，也基于测序读出，通过将条形码寡核苷酸固定在载玻片上实现空间条形码，即空间转录组工作流程（图5d）。

在DSP中，光解性寡核苷酸被连接到抗体以用于蛋白质检测，或连接到核酸探针用于转录物检测，光解后按所需模式去除，收集，然后测序或计数以识别所选择区域中的目标分子（图5e）。目前为止，DSP可以实现单细胞敏感性，通常用于对70-80种蛋白质进行分析，在某些情况下，连续切片的FFPE组织中可达到1,400-2,100个转录物。

de Souza N, Zhao S, Bodenmiller B. Multiplex protein imaging in tumour biology. Nat Rev Cancer. 2024;24(3):171-191. doi:10.1038/s41568-023-00657-4IF:78.5 Q1

关于知微  

知微生物科技（郑州）有限公司是一家致力于单细胞原位空间表型分析的科技服务公司，可提供一站式解决方案。业务范围为全景多重免疫荧光技术服务（含数据分析），包括基于RNA水平的RNAscope技术和基于蛋白水平的TSA（酪胺信号放大）和CODEX（组织循环染色）技术，共同协助组织微环境空间表型的探索，解码生命的奥秘，助力精准医疗发展和科研临床转化研究。