Nature子刊 | snRNAseq+空间转录组+smFISH+PhenoCycler揭示肾结石患者的空间锚定细胞和分子图谱

1、肾组织中细胞类型的鉴定和定位

从 49 个成人肾脏样本中获得了 280,053 个snRNAseq 图谱，这些样本涵盖一个新数据集（79,717 个细胞核）和人类生物分子图谱计划 （HubMap）和肾脏精准医学项目 （KPMP）数据集（200,336 个细胞核）。利用该数据集深入了解了人肾中的细胞类型多样性以及与皮质髓质细胞类型相比的独特特征（图 1a-f），鉴定的细胞类型有：髓内集合管的主细胞（PapPC）和插层（IC）细胞、下降和上升的细肢、状表面上皮细胞和内皮细胞、以及相当多的基质细胞和免疫细胞。另外，与皮质和髓质相比，PapPC和成纤维细胞的比例最高，状细胞和皮质髓质主细胞之间的基因表达存在显著差异。

除了鉴定出健康的PapPC1群体外，还鉴定出富含应激/损伤基因的PapPC2群体（图1f），PapPC1 和 PapPC2 细胞均表达经典状 PC 标志物;然而，PapPC2 细胞也表达损伤标志物，例如 VIM、JUNB、JUND、LCN2 和 MAP1LC3B （LC3）。为了验证这些细胞类型并确定它们在肾组织中的空间位置，研究者使用了空间转录组学（ST），并绘制了 snRNA-seq 标记图谱，在组织中识别并绘制了PapPC1、PapPC2和未分化细胞的特征。PapPC1和PapPC2经常共定位于相同的集合管，这表明PC的这些不同亚型在集合管中并未在空间上分离。随后使用smFISH来验证这些独特细胞类型的存在（图1p、q），与 PapPC1 细胞相比，集合管中的 PapPC2 细胞具有高表达的 MMP7 和 IGFBP7，未分化的细胞通常定位于间质间隙或小管，形态上与细肢一致。它们具有 IGFBP7 的高表达，并且经常共表达 PROM1，这表明退行性状态改变。

图1：人肾的空间锚定细胞和分子表征

图2：CODEX多重成像

2、肾组织中CaOx结石形成的转录组学特征

接下来，使用snRNAseq 数据比较了结石和对照样本中的不同细胞类型和基因表达差异。与对照样品相比，结石样本中未分化细胞的比例显zh增加。此外，结石样本中的多种细胞类型表达了损伤和应激基因水平的增加，例如 SPP 1、CLU、LCN2、S100A11 和 MMP7。通路分析还发现，结石病患者中与蛋白质翻译相关的常见通路显著富集。结石样品的ST显示，未分化的细胞经常局限于矿化区域附近，很可能是相邻小管局部损伤的结果（图3e–h)。

为进一步了解结石病损伤的发病机制，研究者更详细地研究了MMP7表达，MMP7是一种参与损伤和基质重塑的基因，在结石病患者的组织中持续上调。有趣的是，在对照组织中，MMP7 局限于 CD，但在结石患者中，MMP7 显示出弥漫性表达模式，（图 3d, j），使用共聚焦 3D 成像和组织细胞术分析 MMP7 表达显示，MMP7高表达（可能与PapPC2相对应）的集合管细胞比例随着结石病的增加而增加，与转录组数据一致。这些数据表明结石病将集合管和其他肾小管细胞的表型改变为损伤表型。这些变化可能引发免疫和纤维化反应，最终取代健康肾小管上皮组成。

图3：人肾结石组织的差异表达基因和细胞状态

3、矿化和非矿化组织的区域分析

矿物沉积，如兰德尔斑块 （RP） 的形成，被认为在结石病的形成中起着重要作用。然而，斑块的形成通常是局灶性的，矿床微环境中存在的细胞和分子改变可能在这种疾病的发病机制中很重要。基于结石中矿床的选择对空间转录组图谱的监督分析，结果表明，与矿物更远（非连续）的区域相比，NEAT1、CHIT1、LYZ、SPP1 和 MMP9 等基因的转录特征在与矿化组织相邻的区域上调。使用CODEX成像技术，在蛋白质水平上也验证了SPP1在矿化区域的高表达。

为更好地定义矿化病灶的生态位，并了解其对损伤的贡献，特别是对发现的免疫细胞标记基因的富集及其与矿物质沉积的关联，将CODEX多重成像与一组针对不同免疫细胞类型的抗体结合使用，利用了矿床的自发荧光特性，从而可以在不染色的情况下识别斑块，在对照组织中鉴定的主要细胞簇在这里也被鉴定出来。对初始分析中的CD45+细胞簇进行了额外的无监督分析，将免疫细胞分解为主要淋巴细胞和骨髓细胞簇。后者根据CD68、CD11c和CD206等标志物大致可分为三类，它们对应于炎症（M1、CD68 高和 CD11c 高），选择性激活（M2，CD68低，CD206+）和中间表型（M1 / M2，CD68+，CD206+）。将免疫细胞映射回组织图像显示，斑块沉积的某些区域可作为免疫激活的病灶。这些数据表明斑块的存在具有免疫原性。矿物质沉积可能引起不同的免疫反应，从髓系到混合淋巴细胞浸润的明确进展，以及由活化的成纤维细胞和肌成纤维细胞组成的非重叠纤维生成反应，用于修复受伤组织。

图4：CODEX对带有矿物质沉积的组织进行成像，可识别斑块周围免疫激活和纤维化的各个阶段

4、大规模 3D 成像和组织细胞术将炎症应激信号传导和巨噬细胞活化确定为结石病的主要特征

图5：氧化应激 （ROS） 和巨噬细胞活化的蛋白质标志物在结石患者的活检中弥漫性增加。

5、肾结石患者尿液中 MMP7 和 MMP9 水平升高，并与疾病活动度相关

snRNAseq 和 ST 数据集显示结石病患者中 MMP7 基因表达上调，矿化区域表MMP9 基因达上调。接下来，研究者探究了结石病患者的尿液分泌物是否可以筛查结石病活动。为此，研究者检测了 55 名肾功能正常患者的尿液样本中的 MMP7 和 MMP9，并分为 3 组：1） 没有已知结石临床病史的健康对照，2）具有已知结石临床病史但近期没有结石事件的非活动性 CaOx 结石形成者，以及 3） 正在接受结石去除手术的活性 CaOx 结石形成者。结果表明，与健康受试者相比，没有活动性疾病的 CaOx 结石患者尿液中 MMP7 、MMP9水平增加，在活动性结石形成者中，观察到尿液中MMP7、MMP9水平更高。这些结果表明，MMP7 和 MMP9 都是监测结石病活动的潜在重要标志物。