Nat Immunol | 组织原位的多重RNA和蛋白检测探索非小细胞肺癌患者多细胞网络中免疫中枢空间信息

2024年3月19日，来自美国哈佛大学医学院的研究团队在《Nature Immunology》（IF=30.5）上发表了“Human lung cancer harbors spatially organized stem-immunity hubs associated with response to immunotherapy analysis”的研究成果。通过研究人类免疫治疗前肺癌样本中的免疫枢纽，发现了一种被称为干细胞免疫枢纽的特殊免疫细胞集合体，并与PD-1阻断治疗的积极反应密切相关。该枢纽与成熟的三级淋巴结构不同，含有干细胞样T细胞、激活的树突状细胞和成纤维细胞，并富含相关趋化因子。在干细胞免疫枢纽内，研究人员还发现特定细胞类型之间存在着优先的相互作用。该项研究为了解人类肿瘤内免疫反应的空间组织以及其对免疫治疗结果的影响提供了重要见解。

多细胞网络在调节免疫应答中至关重要。在一项基于结直肠癌样本的转录特征和多光谱成像的共变分析中，研究人员发现激活的T细胞表达IFNG，与表达干扰素刺激基因（ISG）的恶性和髓样细胞相邻，包括T细胞吸引趋化因子CXCL10和CXCL11。这一发现表明存在一种正反馈循环，其中激活的T细胞可以促进更多的T细胞招募。

先前的研究表明，免疫治疗结果（包括肺癌在内）与干扰素（IFN）-γ相关的表达特征呈正相关，包括黑色素瘤中的T细胞吸引趋化因子CXCL10。此外，干细胞样TCF7+PD-1+CD8+T细胞群体已与随后患者对免疫治疗的反应相关联，并且显示在小鼠中形成肿瘤特异性效应CD8+T细胞增殖爆发的储存库，这对免疫治疗反应至关重要。然而，这些T细胞状态的空间组织及其与肿瘤微环境中其他细胞的关系尚不清楚。

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，而PD-1阻断是主要的免疫检查点抑制治疗，尽管只有部分患者对治疗产生反应。通过对未接受免疫治疗的非小细胞肺癌（NSCLC）患者的肿瘤组织进行多重RNA和蛋白质成像以及空间转录组学分析，研究人员定义了参与抗肿瘤免疫应答的多细胞网络，这些发现对于预测和增强免疫治疗结果具有重要意义。

本研究收集了马萨诸塞州总医院 （MGH）接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗的68例非小细胞肺癌患者的全组织切片（其中48例患者对治疗不起反应，20例患者对治疗起反应），利用RNA smFISH和多重免疫荧光染色这两项技术，组合出两套染色方案（Panel1和Panel2），使用数字病理分析软件进行细胞分割和表型分析，并将RNA探针染色图片与抗体染色图片进行整合和细胞聚类分析，在一张图片上同时表征了细胞表型标记物与细胞因子的空间特征，结合组织原位的空间转录组分析共同探究了人类免疫治疗前肺癌标本中的免疫中枢。

  研究结果 

2、 一种有利的富含干细胞样T细胞的免疫枢纽亚型

研究人员假设免疫枢纽可能存在不同细胞组成的亚型。通过对2,712个免疫枢纽进行无监督子聚类，发现了七个亚簇，它们在多个患者中都有代表性。其中，亚簇3在响应者患者中面积比例显著增加，与更好的进展无病生存期和总生存期相关。

随后对免疫枢纽亚簇进行分析发现，与其他亚簇相比，亚簇3富集了IFNG+细胞、TCF7+CD8+T细胞和干细胞样TCF7+PD-1+CD8+T细胞。这些细胞在整个肿瘤微环境中形成了独特的定位点，特别是干细胞样TCF7+CD8+T细胞，其在亚簇3中的存在与积极的治疗反应密切相关。因此，将亚簇3称为“干细胞免疫枢纽”。 此外，包含CXCL10/CXCL11表达和TCF7+细胞的生态位的共同存在与PD -1阻断反应性的相关性，比任何一个特征单独的存在都更强。

3、干细胞免疫枢纽富集了成熟调节性树突状细胞和CCL19的表达

为全面了解NSCLC肿瘤内的空间组织枢纽，研究人员采用了多重误差稳健FISH（MERFISH）技术，对479个标记免疫、基质和上皮细胞状态的基因进行了单细胞分辨率的检测（图3a）。通过分析四个具有CXCL10/CXCL11+表达和大组织面积的NSCLC病例的样本，研究对肿瘤微环境中的细胞进行了表型分析，识别了1,488,870个细胞，并被注释为7个谱系（图3b）。

随后，研究人员尝试识别这些细胞可能所在的空间邻域，将肿瘤组织分成2500 μm²的瓦片，并根据基因表达的可变性进行Louvain聚类，共识别出14个瓦片聚类，包括干细胞免疫枢纽、非干细胞免疫枢纽、血管枢纽以及其他肿瘤区域。干细胞免疫枢纽聚类显示CXCR3配体、TCF7+CD8+T细胞和TCF7+PD-1+CD8+T细胞富集。

此外，分析发现，除了CXCL9/CXCL10/CXCL11之外，干细胞免疫枢纽还富集了编码趋化因子CCL19及其受体CCR7的转录本（图3d,h）。

4、趋化因子受体对优先在髓系- T细胞中相互作用

接下来研究人员使用空间配体-受体分析，通过COMMOT算法和CellChat3数据库中精心筛选的配体-受体对，推断了干细胞和免疫MERFISH细胞对之间的统计学上合理的信号通路。结果显示干细胞免疫中枢包含髓系- T细胞相互作用的两个轴，mreg DC与Treg细胞/CD4+ T细胞(可能通过CCL17/ CCL22-CCR4和CCL19-CCR7联系)和CXCL10+巨噬细胞与CD8+ T细胞(可能通过CXCL9/CXCL10/ CXCL11-CXCR3联系)。

研究人员将MERFISH数据与肺腺癌的单细胞RNA测序数据整合，对成纤维细胞和血管细胞进行了细粒度聚类分析。他们发现成纤维细胞亚群中的CCL19表达与干细胞免疫枢纽中的显着富集相关。这项研究还发现，CCL19+成纤维细胞在干细胞免疫枢纽中的富集可能为干细胞免疫的活动提供了支持。

为了研究CCL19+成纤维细胞与其他细胞的相互作用，研究人员通过基于索引的共定位分析发现，在干细胞免疫枢纽中，CCL19+成纤维细胞与mreg DCs共同与B细胞和CD4+T细胞相互作用，而mreg DCs则与Treg细胞发生共定位。CCL19+成纤维细胞利用CCL19招募CD4+T细胞，通过CCL19-CCR7、CCL21-CCR7和CXCL12-CXCR4相互作用，这表明CCL19+成纤维细胞在干细胞免疫枢纽中发挥了重要作用。

研究表明，由于具有TCF7+细胞和CCL19表达，故测试了干细胞免疫中心是否为三级淋巴结构（TLS）。基于空间原位多重荧光染色和空间转录组检测癌症相关转录组数据，发现免疫中枢不具备成熟的B细胞，结合干扰素刺激基因ISG和其他巨噬细胞和T细胞标记物的表达结果，证明免疫中枢不同于三级淋巴结构TLS。

  研究结论 

参考文献

关于知微 

知微生物科技（郑州）有限公司是一家致力于单细胞原位空间表型分析的科技服务公司，可提供一站式解决方案。业务范围为全景多重免疫荧光技术服务（含数据分析），包括基于RNA水平的RNAscope技术和基于蛋白水平的TSA（酪胺信号放大）和CODEX（组织循环染色）技术，共同协助组织微环境空间表型的探索，解码生命的奥秘，助力精准医疗发展和科研临床转化研究。