Nature | PhenoCycler联合多组学技术全面绘制人类乳腺的单细胞基因组图谱

1、 成年人乳腺中的主要细胞类型

为了确定乳腺的主要细胞类型，作者利用ScRNA-seq和SnRNA-seq技术共揭示出12个主要的细胞类型簇（图1c）。这些细胞类型包括：三种上皮组分：腔内激素响应性（LumHR）、腔内分泌（LumSec）和基底-肌上皮（basal）；两种内皮细胞（淋巴管和血管）；三种免疫细胞（T细胞、B细胞和髓样细胞）；两种间质细胞类型（成纤维细胞（fibro）和周血管细胞），以及脂肪细胞和肥大细胞。

图1：成人乳腺的主要细胞类型

2、 细胞邻域的空间映射

通过组织病理学，人类乳腺组织可以分为四个主要的区域：脂肪组织、结缔组织和上皮富集区域，进一步细分为小叶和导管区域（图1a）。接下来，作者使用空间转录组学（ST，10x Genomics）、单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）、CODEX三种技术进行了蛋白质组分析，以研究细胞类型在组织原位的空间分布。

首先，ST技术揭示了9个主要细胞簇（图2a–c），不同区域的细胞组成不同。例如，脂肪区域主要含有ST1-脂肪细胞，结缔组织区域含有升高的ST3-成纤维细胞和ST9-血管细胞簇，导管区域含有更高比例的ST6-腔内分泌/基底细胞等（图2c）。

其次，smFISH分析在原位验证了许多顶级标记基因（图2d–f），显示了不同细胞类型的空间分布。例如，三种上皮细胞类型与B细胞和T细胞共定位，而成纤维细胞与血管和淋巴细胞共定位（图2e）。细胞邻域分析显示了不同细胞类型之间的关系，以及它们在不同区域的分布。例如，结缔组织区域主要由成纤维细胞和血管内皮细胞组成，导管区域主要由基底细胞和高水平的腔内分泌细胞组成，小叶区域由基底细胞以及高水平的腔内激素响应细胞组成（图2f）。

进一步地，CODEX技术成像解析了乳腺细胞类型的空间分布，并确认了不同细胞类型在乳腺组织中的存在（图2g）。细胞接近性分析（图2h）结果与smFISH数据一致，进一步确认了不同细胞类型之间的空间关系。综合而言，这些数据提供了对乳腺组织不同地形区域的细胞组成和空间分布的全面理解，并为进一步研究乳腺生理和疾病提供了重要信息。

3、 导管和小叶中的上皮细胞

无偏聚类确定了三种主要的上皮细胞类型：基底、LumSec和LumHR，与先前的研究结果一致（图3b、c）。为了解决上皮多样性，作者对每种上皮细胞类型进行了独立的亚聚类分析，结果显示，在不同的女性之间存在差异的细胞状态（图3e-j）。基底细胞表达ACTA2和TP63，并且EPCAM水平较低，这与它们在基底膜产生和肌上皮功能中的作用一致（图3j）。在LumHR细胞内部，确定了三种不同的细胞状态，分别是LumHR-major、LumHR-SCGB和LumHR-active。这些状态具有不同的基因表达特征，如EGLN3、MUCL1、PIP、分泌球蛋白等，与其在激素依赖性增殖中的作用相关（图3j）。LumSec细胞显示了最大程度的多样性，具有七种不同的细胞状态（图3g、j）。LumSec-major状态以MMP7表达为标志（图3j）。总之，作者确定了乳腺组织中11种不同的上皮细胞状态，并且细胞间相互作用分析表明这些上皮细胞状态之间存在活跃的相互交流。

接下来，为了解决上皮细胞状态的空间分布，作者使用了MERFISH技术，发现许多上皮细胞状态没有特定的导管-小叶定位，而其他细胞状态则显示不同定位，例如LumSec-basal主要定位于导管，而LumSec-KIT和LumSec-major主要定位于小叶。

进一步使用其他空间技术比较了导管和小叶区域。ST技术显示导管区域与LumSec相关基因相关联，而小叶区域显示了LumHR特异性基因的表达增加（图3o）；类似地，smFISH分析显示出类似地结果（图3p、q）；使用CODEX发现，导管中KRT5和KRT19的水平较高，而小叶中较低。这些分析表明，虽然LumHR和LumSec细胞在导管和小叶之间的丰度不同，但两种细胞类型均存在于导管和小叶的腺泡结构中（图2c、f、i）。

图3：人乳腺组织的上皮细胞

4、 正常乳腺的免疫生态系统

ScRNA数据显示，免疫细胞被组织成三个主要群体（髓系、自然杀伤细胞（NK）、T细胞和B细胞）。在NK和T细胞中，识别出14个亚群（图4f、g）。CD4+ T细胞包括静止T细胞（SELL）、T辅助细胞（TH）和TH-like（IL7R、CCR6、CCL20）、T效应记忆细胞（TEM）（LMNA）和T调节细胞（Treg）（FOXP3、CTLA4）。此外，还识别出两个CD8+ T细胞群体，T驻留记忆细胞（TRM；ITGA1）和TEM（GZMK）。

ScRNA测序数据集中B细胞的聚类显示了三个主要亚群，包括记忆细胞、浆细胞和初始细胞（图4h、i）。

在髓系细胞中，ScRNA-seq数据解析出树突状细胞（DCs）、单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞亚群（图4j、k）。虽然NK、T、B和髓系细胞状态显示出不同的频率，但它们在126名女性中得到一致鉴定，表明它们在正常乳腺稳态中发挥着作用。

作者利用smFISH解析了7种免疫细胞类型（单核细胞、巨噬细胞、CD4+ T、CD8+ T、CD4+ Treg、DCs和B细胞）的空间组织，所有七种免疫细胞类型存在于三个主要的组织区域（结缔组织、导管、小叶）（图4l–n）。相对于结缔组织区域，导管和小叶区域含有更高密度的免疫细胞。对选择的免疫细胞状态进一步进行smFISH空间分析，发现巨噬-m1（C3、RGS1）主要存在于导管和小叶区域。B细胞富集于上皮区域，在结缔组织区域很少。浆细胞B细胞（IGA和IGG）在导管和小叶区域中都有发现，初始和记忆B细胞（CD37、LTB、IGHD）主要存在于小叶区域。

图4：人类乳腺组织中的免疫细胞生态系统

5、 乳腺中的成纤维细胞多样性

通过单细胞RNA测序对来自患者队列的乳腺成纤维细胞进行了分析（图5b、c），结果表明，乳腺中存在多种不同的成纤维细胞状态，包括与基质重塑、胶原基因表达、前胶原形成、血管生成以及组织重塑和WNT信号传导相关的状态。进一步，使用CODEX技术研究了乳腺成纤维细胞的空间分布，结果显示成纤维细胞存在于乳腺的小叶间和小叶内区域（图5e）。这些发现揭示了乳腺中成纤维细胞的多样性和功能多样性，对于理解乳腺生物学和相关疾病具有重要意义。

6、 乳腺脂肪组织

乳腺脂肪组织（图5f）在人类乳房中占据着很大比例，然而，由于脂肪细胞体积大、脂质含量高和易碎的特性，导致单细胞RNA测序方法无法捕获脂肪细胞。因此，作者采用了snRNA-seq和ST等方法，成功捕获了乳腺脂肪细胞的转录组数据（图5g、h）。分析显示，乳腺脂肪细胞主要高表达了一系列基因，包括ADH1B、CD36、PLIN1等（图5i），研究还表明，乳腺脂肪细胞主要属于白色脂肪细胞类型。最后，研究还发现了脂肪细胞与成纤维细胞以及髓系细胞之间的潜在细胞间相互作用。

7、 血管和淋巴细胞

乳腺是高度血管化的器官，包含动脉和静脉网络（图6a），其中血管内皮细胞在正常乳腺组织中占据相当比例。单细胞RNA测序分析揭示了血管内皮细胞的三种主要状态：动脉内皮细胞、静脉内皮细胞和毛细血管内皮细胞，并发现了许多新的顶级标记基因（图6b、c）。

淋巴网络在乳腺组织中存在，用于清除细胞废物（图6d）。淋巴内皮细胞出现在较低频率下，经聚类分析确定了四种主要的淋巴细胞状态（图6e，f）。

作者利用四种空间平台对血管和淋巴细胞状态的定位进行了调查。ST数据揭示了血管和淋巴细胞的独立分布模式，与组织病理学中的血管结构相符。smFISH和CODEX数据显示了毛细血管和淋巴细胞的分布情况（图6g、h），表明了它们在不同乳腺区域内的密集程度和分布模式。

8、 乳腺的血管周围细胞

除了血管之外，血管周围细胞还支持并调节血管内的血流（图6i）。通过单细胞RNA测序数据聚类，确定了两种主要的细胞亚型：外周细胞和血管平滑肌细胞（VSMCs）（图6j）。外周细胞表达了多种基因，包括免疫信号传导和基质产生相关基因，而VSMCs则表达了平滑肌相关标记基因（图6k）。空间分析显示，外周细胞主要分布在小叶区域，并且与血管细胞共同定位，而VSMCs则围绕在动脉周围，显示了它们在乳腺中的空间分布特点。

9、 临床数据相关性

最后作者研究了乳腺细胞类型和细胞状态频率与临床元数据的关联。分析结果显示，不同种族和年龄组以及绝经状态的妇女，在乳腺细胞类型和状态上存在显著差异。与高密度乳腺相关联的是基底上皮细胞的减少和淋巴细胞类型的增加。肥胖或高身体质量指数与增加的成纤维细胞和髓样细胞相关，而产子状况则显著与T细胞水平增加相关。总体而言，种族、年龄和绝经状态与乳腺细胞类型和状态组成的变化最为关联。