Cell: 组织学结合单细胞成像技术构建结直肠癌（CRC）的2D和3D空间图谱

组织学一直是癌症诊断和治疗的基石。在 CRC 中具有既定意义的组织学特征包括：（1）相对于正常上皮细胞和肿瘤细胞形态的分化程度（例如，细胞形状、细胞核大小等）和细胞邻域的组织（例如，腺体组织、细胞增多等）；（2）侵袭边缘的位置和形态，包括“肿瘤芽”的存在，即被基质包围的小簇肿瘤细胞与不良结局相关（即局部复发、转移和癌症相关死亡的风险增加）；（3）T细胞浸润的程度以及瘤周三级淋巴结构 （TLS）（B 细胞、T 细胞和其他免疫细胞类型的有组织聚集体）的存在。在许多情况下，这些组织学特征的起源和分子基础尚不完全清楚。

在本文中，作者结合了多重循环免疫荧光（CyCIF）以及具有单细胞测序和微区转录组学的 CRC 的 H&E 图像，构建出大规模的结直肠癌二维和三维空间图谱。这些图谱在组织学特征之上叠加了大量的分子信息，以提供关于癌症结构的新信息，以及它如何形成、进展和与免疫系统相互作用。。

1、多重成像分析表征CRC样本中混合和分级的形态学和分子特征

对包括组织学和分子亚型在内的93个FFPE CRC人类样本进行了CyCIF和H&E成像，采用了三种不同的方式（图1A）。（1）采用连续切片成像结合scRNA-seq和GeoMx转录组学的方式对CRC1样本（图1B–1E）进行3D分析；（2）对16个额外样本（CRC2-17）进行2D全玻片成像（WSI）；（3）将CRC2-17 和 77 个额外的肿瘤 （CRC18-93） 作为 TMA 的一部分进行成像；在每种方式下，均使用CyCIF技术检测针对上皮细胞、免疫细胞和基质细胞群的102种谱系特异性抗体以及细胞周期状态、信号通路活性和免疫检查点表达的标志物。

CyCIF数据上的t-SNE显示出细胞角蛋白阳性（CK+）上皮细胞（包括正常和转化的）与CD31+内皮细胞（主要是血管）、Desmin+基质细胞和CD45+免疫细胞之间的明显分离。免疫细胞进一步分为生物学上重要的类别，如CD8+PD1+的细胞毒性T细胞（Tc）、CD4+辅助T细胞、CD20+ B细胞、CD68+/ CD163+巨噬细胞，以及离散的亚类别，如CD4+FOXP3+的Tregs细胞。CRC1样本的scRNA-seq结果估计的细胞类型丰度与图像数据的估计结果表现出高度一致性。

Main CyCIF antibody panel; used for CRC1, CRC2-17, and TMAs

图1：数据收集策略和全玻片成像结果

另外，作者发现样本尺寸长度与复发性形态学特征直接相关，因此，接下来作者探究了样本尺寸对 3D、2D WSI 和 TMA 数据统计分析准确性和精确度的影响（图2）。最终的分析结果表明，对 TMA 核心和其他类似小 FOV 的分析不足以准确确定细胞丰度等简单的特征，因为样本相对于特征尺寸太小。3D 标本的 2D 全玻片成像通常不会遇到与 TMA 或小 FOV 相同的子采样问题，并且许多中等尺度的肿瘤特征只能在三维数据中检测到。

图2：区域抽样的空间异质性和误差估计

将多重图像特征与CRC中具有确定预后价值的组织学特征联系起来，例如肿瘤分化程度（良好、中等、差）、分级（低级、高级）、亚型（黏液性、印戒细胞等）。为了识别与每种组织学相对应的分子特征，使用病理学标签上的分子特征（CyCIF 强度）训练 k 最近邻 （kNN） 分类器（图3）。结果表明，分类器仅使用标记强度编码了与疾病相关的形态。但是，没有一个单一的分子标记物是特定的ROI或组织形态所独有的，这意味着形态学被编码在高维强度特征中。

随后，作者在17个肿瘤中，通过CyCIF数据分析发现了不同程度的组织学交错特征，有些肿瘤呈现出连续的单一形态块（如CRC5），而其他一些肿瘤则呈现出不同组织学类型的交错。因此，用于病理学分级的高度特征性的组织学表型在CRC中以离散和混合形式存在，这很可能是由于表观遗传学而不是遗传学的异质性所致。

此外，作者还发现CyCIF标志物表现出强度梯度，在某些情况下包括整个肿瘤，而在其他情况下则与局部形态梯度相吻合。显示了四个示例：从正常腺体特征转变为异常腺体特征的样本肿瘤区域，与从E-钙粘蛋白表达到PCNA的转变相吻合（图3D;左）；粘液-固体转变与CK20 和CK 18 梯度呈负相关（图3D;中心）；交替的腺体-固体转变（图3D;右，黄色弯曲箭头）;腺体-固体转变与H3K27ac 和H3K27me3 水平的渐变相吻合（图3D;右，白色箭头;在 CRC4 中也可见，CRC5 在图3G)。H3K27ac和H3K27me3表观遗传标记在转录调控中发挥互补作用，进一步证明了肿瘤微环境中有组织的表观遗传状态。

图3：形态学和分子肿瘤表型的相关性和预测

2、在深部侵袭前沿的肿瘤萌芽和分子转变

肿瘤芽的诊断标准是肿瘤浸润边缘存在 1-4 个细胞簇，周围有基质，并表达与浸润和转移作用一致的 EMT 样特征。根据国际肿瘤萌芽共识会议（ITBCC）的标准，一位病理学家在检查的17个CRC标本中的10个中共识别出约7X10^3个肿瘤萌芽细胞（图4A）。在CRC1中，肿瘤萌芽主要局限于浸润前缘的一个约2.0×0.7×0.4毫米的区域（区域IM-A，图4B），靠近正常结肠上皮并夹杂着T细胞（图4B）。而在三维图像中，作者发现这些“ITBCC萌芽”经常彼此连接，并与主要的肿瘤组织相连（图4C、4D）。因此，经典定义的萌芽看起来主要是这些纤维结构的横截面视图。

为了客观地分析这些结构，作者使用了 Delaunay 三角测量法识别彼此紧邻的 CK 细胞（图4E)。分析结果表明，最小簇中的 CK 细胞表达最低的 E-钙粘蛋白水平，并且增殖标志物（例如 PCNA）也以低水平表达 （图4G）。

图4：肿瘤出芽是一种与分级分子和形态转变相关的分布现象

这些图谱还为肿瘤的结构提供了新的见解。在 2D 视图中，芽状结构周围的粘蛋白存在于看起来彼此隔离的水池中 （图5D箭头）。然而在 3D 视图中，这些粘蛋白池通常彼此连续，并延伸到距离结肠腔最多 1 厘米的地方;在 CRC1 中，这种情况在涉及浸润边缘IM-B的中心区域最为明显（图5E）。因此，作为孤立结构可见的芽和粘蛋白池实际上在 3D 中通常相互连接 。由此，作者得出的结论是：CRC1 中的 EMT 样转变和肿瘤出芽的特征不是像 Weinberg 及其同事在组织培养中首次描述的那样形成孤立的细胞球，而是通过形成大的纤维状结构，当从其远端的横截面上观察时，这些结构似乎是小芽。这是对这些肿瘤结构的一种全新的观察。

图5：2D 中小的、孤立的肿瘤和粘蛋白结构是 3D 中大型的、连接的网络

3、3D TLS 网络显示 TLS 内部模式变化

TLS是一种非淋巴组织，在肿瘤和其他慢性炎症部位发展，其存在与良好的预后和免疫检查点抑制剂 （ICI） 反应性有关。对 CRC1 的 47 个单独切片（22 个 H&E 和 25 个 CyCIF）进行病理学检查，在 2D 中发现了 900 多个不同的 SLO 和 TLS 结构域 （图6A），但是作者发现这些结构域是相互连接的，形成了更大的3D结构，例如，七个大型网络 （图6B）。为进一步研究三级淋巴结构网络的细胞组分，作者对CyCIF数据进行了K-means聚类，恢复了具有SLO特性的簇（图6D），并将这些标记簇投影到TLSN-B的3D重建图上（图6G），观察到了 TLSN-B 粘液侧的髓样细胞（CD68/CD163）, T 细胞（CD3、CD45RO、CD4）, B 细胞（CD20CD45）。

从这些数据中作者得出结论：在 CRC1 中对 TLS 的单一 3D 重建是整个队列的一个合理示例，表明：（i） TLS 形成相互连接的 3D 网络，而不是在 2D 切片中观察到的孤立结构，（ii） 单个肿瘤内的 TLS 网络可以具有不同的细胞组成，以及 （iii） 单个大型 TLS 网络内细胞类型和功能标志物的变化是分级的， 暗示 TLS 内部的模式化和通信。

图6：3D成像TLS结构和组成

4、PD1-PDL1 相互作用主要发生在 CRC 队列中的 T 细胞和髓样细胞之间

肿瘤边缘的免疫反应强烈影响疾病进展和 ICI 反应性。在CRC1浸润边缘发现的三种形态中，IM-A区域（萌芽浸润边缘）具有最大的免疫细胞密度（图7A），但也具有强烈的免疫抑制作用，且PD-1和PDL-1在芽附近富集，IM-B（粘液浸润边缘）表现出最小的免疫细胞浸润，IM-C（推动浸润边缘）富含Tregs，但相比 IM-A，PDL1 细胞很少（图7C、D）。

为了量化肿瘤边缘形态和分子特性之间的关系，作者使用了LDA，概率建模方法，可将复杂结构简化为不同的组件群落。结果表明，CRC侵袭边缘的结构域可从形态学上区分为具有不同水平的肿瘤增殖细胞（芽低和侵袭边缘高）、信号通路激活和免疫抑制。

图7：CRC及其侵袭边缘的免疫景观

PD1 和 PDL1 之间的免疫抑制作用可以在 CRC 中靶向治疗，因此具有临床意义。在CRC1-17中，PD1细胞的比例变化了4倍。虽然少数 （1-5%） 肿瘤细胞表达 PDL1，但最有可能是 PDL1 的细胞是 CD68（14-51% 阳性）和 CD11c 髓样细胞（10-88% 阳性）。

从功能上讲，与 T 细胞抑制相关的不是 PDL1 细胞的流行，而是哪些细胞足够接近 PDL1：PD1 结合。为了研究这一点，作者使用 20 μm 截止值进行了邻近分析，发现在 24 个 CRC1 切片中，与 PD1 细胞相互作用的细胞对 CD45 强烈富集，而对 CK 耗尽，表明 PD1 T 细胞与 PDL1 免疫细胞的相互作用比 PDL1 肿瘤细胞更常见。CRC2-16也是如此，但CRC17是唯一的例外（图7J）。最后，12 重 CyCIF 的高分辨率光学切片提供了骨髓细胞上 PDL1 与肿瘤边缘的 PD1 T 细胞共定位的直接证据，这与功能性细胞间相互作用的形成一致（图7L）。在CRC 队列中，PD1 T 细胞的免疫抑制最常涉及 PDL1 髓系，而不是肿瘤细胞。然而，表达 PDL1 的肿瘤细胞可能参与某些肿瘤的免疫抑制：在 CRC1 中表达 PDL1 的 3% 的肿瘤细胞集中在 T 细胞附近的出芽边缘 （图7K）。