Nat. Commun. | RNAseq+CODEX+mIHC揭示免疫细胞形貌以预测皮肤T细胞淋巴瘤对PD-1阻断的反应

皮肤 T 细胞淋巴瘤 （CTCL） 是一组罕见但可能致命的异质性淋巴瘤，起源于成熟的嗜肤性 CD4 +T 细胞。大约1/3的患者被发现时已处于晚期，5 年生存率为 28%。除造血干细胞移植外，目前尚无针对晚期CTCL的有效或可持续疗法。

最近抗PD-1免疫疗法，帕博利珠单抗（pembrolizumab）治疗晚期皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）的II 期临床试验显示，38%的患者实现了持续的临床反应，而25%的患者经历了疾病进展。尽管存在这些结局差异，但传统免疫组化 （IHC）、基因表达谱和质谱细胞术的生物标志物研究并未预测帕博利珠单抗反应，因此迫切需要新的检测方法和相关计算工具来研究肿瘤微环境 （TME） 并更好地预测对抗 PD-1 疗法的临床反应。

由于免疫系统通过协调的细胞间关联起作用，因此预测 TME 中的细胞空间属性可以预测临床结果。事实上，最近的研究表明，免疫细胞不是随机分布在TME内，而是有目的地组织成细胞邻域和生态位，以促进抗肿瘤或促肿瘤功能。那么PD-1阻断如何改变空间细胞环境，这种变化是否可以预测CTCL患者对帕博利珠单抗治疗的临床反应，研究人员对此进行了探究。

患者队列：来自CINT-10临床试验队列的14名晚期CTCL患者的帕博利珠单抗治疗前后的活检样本，并创建了 FFPE组织芯片，其中包括 70 例患者匹配的治疗前和治疗后皮肤肿瘤

多模式实验方法：利用CODEX多重蛋白成像在组织微阵列中鉴定出117,170个细胞，这些结果与使用激光捕获显微切割和 Smart-3Seq 从连续切片中获得的 64 个组织转录组相结合（即RNA-seq），通过综合计算分析，包括细胞邻域评估和 CIBERSORTx （CSx），分析了CTCL微环境的分子动力学，并鉴定了抗PD-1免疫治疗的预测性生物标志物。mIHC用于验证SpatialScore。

1、CTCL微环境中恶性和反应性CD4+ T细胞的鉴别

根据肿瘤和免疫细胞的空间背景检测生物标志物需要区分恶性和反应性CD4 T细胞。搭建56种抗体组合的CODEX panel，鉴定并验证了 21 种独特的细胞类型，包括反应性CD4 T细胞和恶性CD4 T细胞（即肿瘤细胞）。

此外，通过分析RNA-seq数据，使用L1正则化线性模型确认了与组织微阵列点中肿瘤细胞频率相关的基因。研究结果表明，多个已知的CTCL标记基因（包括 CD27、IL-32、CXCL13、BATF 和 TIGIT）的高表达与更高肿瘤细胞频率相关。

总之，该研究结果表明，CODEX多重成像可以在单细胞水平上区分肿瘤细胞和反应性CD4 T细胞，这得到了蛋白质表达差异、细胞大小测量和基因表达谱的支持。

2、抗PD-1免疫疗法对CTCL肿瘤微环境的深度分析

为了描述TME内肿瘤和免疫细胞的复杂相互作用，研究人员使用CODEX表征了帕博利珠单抗治疗前后CTCL的细胞组成。对CODEX鉴定的21种细胞类型按患者分组进行分类，鉴定出13种免疫细胞类型、6种辅助细胞类型和2种肿瘤细胞类型。CODEX荧光成像清晰地显示了不同细胞类型的标记物，例如，T细胞亚群（CD4、CD8、FoxP3）、巨噬细胞（CD68）、树突状细胞（CD11c）、肿瘤细胞（CD4）、血管系统（CD31）和上皮细胞（panck）。同时，HE图像证实了对组织结构元素的准确染色。

在治疗前或治疗后，应答者和无应答者之间的细胞组成没有差异，肿瘤细胞、免疫细胞和辅助细胞类型的组合频率分别约占所有细胞的三分之一。这一发现与完整的临床试验队列和IHC数据的基线水平一致，显示帕博利珠单抗反应与 T 细胞、巨噬细胞或 PD-1 信号标志物的表达之间没有相关性。

3、PD-1 阻断诱导 CTCL TME 的空间重组

研究人员推测，TME的空间细胞组织结构会反映特定的全局组织模式，这些模式会表现为对pembrolizumab药物的响应和非响应表型。为了量化CTCL组织的结构，他们进行了细胞邻域（CN）分析，以揭示细胞在组织内的局部生态位的组织方式。共确定了10个CN，分别是上皮（CN-1，绿色区域）、免疫浸润基质（CN-2，红色区域）、脉管系统（CN-3，棕色区域）、血管化基质（CN-4，灰色区域）、肿瘤和树突状细胞（CN-5，紫色区域）、淋巴富集基质（CN-6，橙色区域）、肿瘤和混合免疫细胞（CN-7、 青色区域）、肿瘤和 CD4 T 细胞（CN-8，黄色区域）、先天免疫细胞富集（CN-9，蓝色区域）和富含 Treg（CN-10，粉红色区域）。

研究发现，响应者和非响应者之间存在三个 CN 的频率显著差异。在响应者中，富集于肿瘤和树突状细胞以及肿瘤和 CD4+ T 细胞的 CN 出现频率显著较高。这表明响应者在 pembrolizumab 治疗后观察到更多免疫激活的肿瘤微环境，可能是通过 CD4+ T 细胞的激活介导的。相比之下，Treg 富集的 CN（CN-10，粉红色区域）在治疗前和治疗后无反应者中的出现频率明显高于反应者，这表明无反应者具有持续的免疫抑制TME。

这些数据将肿瘤和免疫细胞类型的空间组织与TME的功能免疫状态联系起来，突出了免疫抑制和帕博利珠单抗反应性的特定模式。重要的是，即使树突状细胞、CD4 T 细胞、Treg 或肿瘤细胞的丰度没有差异，患者组之间也发生了这些空间相互作用差异（即 CN-5、CN-8、CN-10）。

4、PD-1+ CD4+ T 细胞、肿瘤细胞和 Tregs 的空间特征可预测 CTCL 中的帕博利珠单抗反应

在CN研究结果的指导下，研究人员正式确定了一种基于CD4 +T细胞，肿瘤细胞和Tregs的空间相互作用的计算评分方法。该评分称为 SpatialScore，计算每个 CD4 +T 细胞的物理距离比及其最近的肿瘤细胞（“右”距离）相对于其最近的 Treg（“左”距离）（图 1）。较低的 SpatialScore（即 CD4 T 细胞比 Tregs 更接近肿瘤细胞）表明 T 细胞效应子活性增加，而较高的 SpatialScore（即 CD4 T 细胞比肿瘤细胞更接近 Tregs）表明 T 细胞抑制增加，因此，SpatialScore可以被视为TME中T细胞效应和免疫抑制活性之间平衡的代表。

由于目前的研究试验了 PD-1 阻断，因此接下来探究了 PD-1+ CD4 T+ 细胞亚群如何影响 SpatialScore。结果表明，在经过pembrolizumab治疗后形成的免疫激活的肿瘤微环境中，PD-1+ CD4+ T 细胞在响应者中被激活以增强其抗肿瘤活性。此外，通过CODEX 和 RNA-seq 数据集还发现，PD-1 +CD4+ T 细胞上调了帕博利珠单抗反应者的细胞毒性效应分子。

5、使用临床多重IHC平台验证SpatialScore

尽管像CODEX这样的高度多路复用的空间方法为深度细胞分析和生物标志物发现提供了原始数据，但将这些发现转化为临床领域，需要将预测性空间特征简化为可以在临床实践中轻松实施的诊断平台。Vectra 与 Phenoptics 工作流程结合使用，是一种市售的、广泛采用的临床 mIHC 成像平台。研究人员设计了一种简化的mIHC染色组合（DAPI、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、FoxP3 和 PD-1），用于捕获用于计算 SpatialScore 的 PD-1 +CD4 +T 细胞、肿瘤细胞和 Tregs。结果表明，由CODEX等高度多重成像平台确定的发现可以转化为Vectra等临床上更易于访问的平台。这对于实施 SpatialScore 概念以识别不同肿瘤类型的免疫治疗反应的生物标志物至关重要。

6、肿瘤细胞特异性的CXCL13表达与对PD-1阻断治疗的良好反应相吻合

最后，为了深入了解驱动 SpatialScore 的复杂分子过程，研究人员通过识别预测 PD-1 +CD4 +T 细胞、肿瘤细胞和 Tregs 之间空间相互作用的基因来检查潜在的募集机制。CXCL13 是一种在良性淋巴细胞和 CTCL 肿瘤细胞上表达的趋化剂。IHC结果显示，与其他患者组相比，治疗后应答者的批量 CXCL13 基因表达显著增加。

然后，研究人员分析了CTCL皮肤肿瘤的公开scRNA-seq数据集，鉴定过表达 CXCL13 的主要细胞类型，注释了10个簇，包括肿瘤细胞，CD4+ T细胞（CD4），Tregs，CD8+ T细胞（CD8），B和浆细胞（B&PC），巨噬细胞（mac），树突状细胞（DC），基质、血管系统（vasc）和角质细胞（KC）。通过CIBERSORTx分析、IHC、mIHC等手段，直观地证实了肿瘤细胞是 CXCL13 的主要表达基因。

这些结果表明，PD-1 阻断显着改变了治疗反应者和无反应者的 CTCL TME。在应答者中，帕博利珠单抗治疗似乎可促进肿瘤细胞中的 T 细胞活化并上调 CXCL13，反过来，CXCL13 过表达似乎将效应/细胞毒性 PD-1 +CD4 +T 细胞吸引到肿瘤细胞，从而促进 CD4 +T 细胞介导的肿瘤细胞抑制和杀伤。

相比之下，无反应者具有持续的免疫抑制 TME，这似乎介导了抑制性 Tregs 和 PD-1 +CD4+ T 细胞之间相互作用的增加，并将该 CD4+ T 细胞亚群维持在耗尽状态。

知微生物科技（郑州）有限公司是一家致力于单细胞原位空间表型分析的科技服务公司，可提供一站式解决方案。业务范围为全景多重免疫荧光技术服务（含数据分析），包括基于RNA水平的RNAscope技术和基于蛋白水平的TSA（酪胺信号放大）和CODEX（组织循环染色）技术，共同协助组织微环境空间表型的探索，解码生命的奥秘，助力精准医疗发展和科研临床转化研究。