知微生物科技（郑州）有限公司_多重荧光免疫组化

2020年9月3日，来自美国斯坦福大学医学院病理学系的Garry P. Nolan 教授在《Cell》上发表了题为“Coordinated Cellular Neighborhoods Orchestrate Antitumoral Immunity at the Colorectal Cancer Invasive Front”的研究性论文。该研究使用CODEX技术分析了35名晚期结直肠癌（CRC）患者的组织，发现了九个具有保守和独特特征的细胞邻域（CNs），其中，不同的CNs在肿瘤中起到的作用以及与患者的预后生存期不尽相同。这项研究为了解复杂的抗肿瘤免疫过程提供了一个框架，强调了细胞和空间邻域之间协调作用的重要性。

研究背景

免疫肿瘤微环境（iTME）是肿瘤、免疫、基质和细胞外成分的复杂组装。这些成分在细胞和组织水平上的组织在抗肿瘤免疫的有效性中起着至关重要的作用。抗肿瘤免疫需要iTME 各组成部分之间有组织的、空间上细微的相互作用。了解有效与无效肿瘤控制中的这种协调行为将推动免疫疗法的发展。

多重成像技术允许捕获单个细胞的许多参数，同时保留其空间位置。先前，已有研究人员应用多重成像技术探索了iTME的细胞功能状态、多种细胞类型之间的空间和功能相互作用，以及这些相互作用如何受到组织环境的调节。在这篇文章中，作者认为：组织生物学至少分为两个层次，不同的组织区域和组成它们的细胞类型（CT）。 为了解某些 CT 如何发挥特殊作用来完成特定的组织过程？特定的组织区域如何相互作用？不同类型的组织如何比较？作者采用了CODEX技术，探究了人类CRC的iTME的动态过程。

研究方法

研究人员根据iTME特征从715名CRC患者的数据库中选择了两个CRC患者队列：一组在肿瘤侵袭前沿表现出大量TLS的从头形成，即“克罗恩样反应”（CLR），共17名CLR患者；另一组定义为没有 TLS 和存在弥漫性炎症浸润（DII），共18名DII患者。然后，构建了专门代表 CRC 侵袭前沿 iTME 的 TMA，利用CODEX技术在TMA上对56种标记物进行成像，比较 CLR 和 DII 患者的 iTME。使用张量技术分解样本中的变化，以从 CT 的角度揭示组织，从 CN 的角度揭示组织，以及这两个视图中的组织是如何耦合的。

研究设计和CRC患者队列

研究结果

1、FFPE优化的CODEX可对存档的人类癌症样本进行高度多重荧光显微镜分析

研究人员首先设计并优化了用于FFPE组织的CODEX平台，以研究存档的人类样本（图1A）。通过对迭代成像方法和单个抗体的广泛测试以及对多种肿瘤样本的TMA染色和分析（图1B），验证了CODEX抗体组合。结果表明，在分析的所有组织中都观察到预期的抗原分布模式，例如正常脾脏、滤泡性淋巴瘤、肝细胞癌、胃癌、乳腺浸润性小叶癌和胸膜弥漫性恶性间皮瘤（图1C）。这些结果表明了，FFPE优化的CODEX适用于临床相关组织中高度多重的单细胞标志物可视化、定量和生物标志物发现。

图1：CODEX工作流程和抗体验证

2、FFPE-CODEX能够对CRC侵袭性前沿iTME中的主要免疫细胞类型（CT）进行原位鉴定和定量

在结直肠癌侵袭性前沿，iTME通常被视为白细胞致密区域与稀疏免疫浸润区域交替出现。TLS（滤泡）在DII 患者的免疫浸润中不存在，但在 CLR 患者的肿瘤中丰富。研究人员对DII和CLR 患者的TMA样本进行了56种标记物的CODEX成像（图2A、B），鉴定并验证了28个独立的CT簇，其中包括 18 个免疫细胞簇、6 个基质和脉管系统簇、2 个混合簇、1 个肿瘤细胞簇和 1 个未定义簇。通过Voronoi 图可视化 CT（图2C），在 CLR 和 DII 患者之间观察到这些免疫细胞簇组成的差异（图2D）。

图2：CRC中免疫浸润组分的空间组成

3、CRC iTME的特征性CN在患者群体中是保守的

作者认为从细胞形成的空间结构来观察患者样本，将有助于深入了解组织iTME的过程。作者将 CN 确定为具有各种 CT 特定局部密度的组织区域，在 CRC iTME 中发现了 9种不同的 CN，这些 CN 概括了与 H&E 染色组织切片中观察到的 CRC iTME 结构组件直接相关的结构。（图3B-E）。然后作者评估了不同CRC患者组之间的CN频率是否不同，结果表明这些发现的 CN 在患者群体中很常见，并且可能代表 CRC iTME 的保守组织区室。

图3：CRC中iTME的特征性CNs

4、DII 患者中肿瘤和免疫成分的偶联与 T 细胞和巨噬细胞 CN 的偶联和碎片化相关

由于鉴定的 CN 提供了与 CT 不同的患者样本视图，因此，作者认为可以同时从CT视图和CN视图更好地理解塑造iTME的基础程序。应用非负 Tucker 张量分解对每个患者组中患者的联合CN-CT组成张量（图4A），确定了“CN模块”和“CT模块”的集合，这些模块可以以不同的方式耦合形成“组织模块”（同时从CT和CN的角度来看）。总之，张量分解表明，在CLR和DII患者中，导致iTME具有明显空间组织的基础程序存在差异。此外，它还表明，在 DII 患者中，肿瘤和免疫过程之间的偶联增加，特别是与 T 细胞和巨噬细胞 CN 之间的偶联和空间接触增加有关。

图4：张量分解表明iTME的组织存在明显差异

5、肿瘤细胞邻域特异性的功能标记物在T细胞亚群上的表达暗示了肿瘤整体中T细胞过程的改变。

要了解iTME，不仅需要从简单的表型描述来理解细胞，还需要从它们的功能状态来理解细胞。作者推测表达不同功能标志物的 T 细胞的相对比例是给定 CN 功能状态的指标，可能与患者预后相关。CD4：CD8 T 细胞比率通常用作确定癌症中 T 细胞功能整体平衡的简单指标，因此，作者计算并可视化了每位患者每个 CN 中 CD4 和 CD8 T 细胞的频率（图5A）。接下来，作者评估了肿瘤CNs（CN-2和CN-6）内的这些频率或其比率是否与总生存期相关。结果表明 CN-6（肿瘤边界）中的特异性 T 细胞活性可能对抗肿瘤免疫反应很重要。

研究还发现CLR 和 DII 患者的 CN 功能状态不同，并且 CN 功能状态可能与抗肿瘤免疫反应相关。具体来说，富含粒细胞的 CN 的功能状态（由其 PD-1+CD4 +T 细胞的频率表示）与 DII 患者的总生存期相关。这些结果表明，富含粒细胞的CN中蕴藏的T细胞亚群活性的某些方面可能有助于积极的免疫活性。

图5：CN功能状态是肿瘤免疫的指标

6、相关的 CN 功能状态提示 DII 患者的 CN 间通讯免疫抑制和通讯网络改变

张量分解表明了不同的CN（细胞领域）可以募集相似的CT（细胞类型），这可以解释为CN间的一种通讯形式。相关性分析发现，在功能性T细胞亚群方面，CN的通信网络在患者组之间存在差异。在 DII 患者中能够观察到 CN-1（富含 T 细胞）和 CN-4（富含巨噬细胞）之间可能存在免疫抑制程序。

图6：CN间通讯改变有利于DII 患者的免疫抑制

研究结论

该研究利用CODEX技术和分析框架系统描述了CRC的iTME，鉴定了多个CNs并探测了它们的组织、功能状态和通讯关系。总之，该研究提供了一种模式框架，用于研究动态组织（如iTME）的空间行为。分析CN及其相关性可以用来揭示其在iTME中发挥的作用，而基于CNs的功能性研究进一步阐明了其中T细胞子集之间相关性，并确定了CNs之间的通信网络。将作者开发工具应用于大型患者队列，有助于理解空间组织行为如何作用于抗肿瘤免疫效应。

参考文献

Schürch CM, Bhate SS, Barlow GL, et al. Coordinated Cellular Neighborhoods Orchestrate Antitumoral Immunity at the Colorectal Cancer Invasive Front [published correction appears in Cell. 2020 Oct 29;183(3):838]. Cell. 2020;182(5):1341-1359.e19. doi:10.1016/j.cell.2020.07.005IF: 64.5 Q1 IF: 64.5 Q1

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知微生物科技（郑州）有限公司是一家致力于单细胞原位空间表型分析的科技服务公司，可提供一站式解决方案。业务范围为全景多重免疫荧光技术服务（含数据分析），包括基于RNA水平的RNAscope技术和基于蛋白水平的TSA（酪胺信号放大）和CODEX（组织循环染色）技术，共同协助组织微环境空间表型的探索，解码生命的奥秘，助力精准医疗发展和科研临床转化研究。

Cell | 细胞邻域（CN）揭示结直肠癌（CRC）肿瘤微环境组织分布特征与抗肿瘤免疫反应的关系

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